La prote�ina supresora de tumores Retinoblastoma
Chemes, Luc�ia Beatriz.
La prote�ina supresora de tumores Retinoblastoma caracterizaci�on de su dominio AB y mecanismo de interacci�on con la oncoprote�ina E7 del papilomavirus humano = The Retinoblastoma tumor suppressor protein: caracterization of its AB domain and mechanism of interaction with the human papillomavirus E7 oncoprotein / Luc�ia Beatriz Chemes ; director: Gonzalo de Prat Gay. - Buenos Aires, Argentina : Universidad de Buenos Aires, 2010.
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
La prote�ina supresora de tumores retinoblastoma (Rb) es una prote�ina "hub" o central que juega un rol central en el control del ciclo celular en c�elulas eucariotas, y su inactivaci�on funcional se encuentra asociada a la progresi�on del c�ancer en humanos. En particular, la interacci�on de la prote�ina HPV-E7 con Rb se encuentra relacionada al poder oncog�enico del papilomavirus humano (HPV). El atraso en los estudios estructura-funci�on de Rb se debe en gran medida a la dificultad para la producci�on recombinante y el estudio en soluci�on de esta prote�ina o sus dominios. En la presente tesis, nos avocamos al estudio en soluci�on del dominio RbAB humano, que media una gran parte de las funciones de esta prote�ina incluyendo la interacci�on con HPV E7. Para ello, desarrollamos un protocolo para su expresi�on recombinante que permiti�o obtener rendimientos de 6 mg/litro con una pureza final mayor al 95 por ciento. Estudios biof�isicos revelaron que RbAB se encuentra en soluci�on como un mon�omero plegado a 20� C. RbAB es marginalmente estable a temperatura fisiol�ogica, y estudios de plegamiento sugieren que los sub-dominios RbA y RbB tienen diferente estabilidad en soluci�on. Estos estudios representan el primer an�alisis sobre las propiedades conformacionales en soluci�on de este dominio. En la segunda parte de la tesis realizamos un an�alisis termodin�amico y cin�etico de la interacci�on entre RbAB y HPV16-E7 en soluci�on. Estos estudios revelaron que el 90 por ciento de la energ�ia de interacci�on es aportado por el motivo lineal de alta afinidad LxCxE, pero que otros sitios secundarios en E7 participan de la interacci�on con el dominio RbAB, indicando que la misma es de car�acter modular. El caracter intr�insecamente desordenado de E7 modula la interacci�on, y la fosforilaci�on de la regi�on CKII-PEST potencia la afinidad del complejo. Estudios cin�eticos revelaron que la uni�on del motivo LxCxE a RbAB sigue un mecanismo de dos estados, con una asociaci�on r�apida y un tiempo de vida en el �orden de 20-200 seg. El complejo E7-RbAB se encuentra estabilizado por interacciones de tipo electrost�atico, que podr�ian determinar al menos en parte la especificidad de la interacci�on de las diferentes prote�inas E7 de papilomavirus. El estudio mecan�istico de las interacciones prote�ina-prote�ina es esencial para comprender el funcionamiento de las intrincadas redes de interacci�on presentes en las c�elulas, y la presente tesis aporta informaci�on sobre una de estas interacciones, tomando como prote�ina modelo a una prote�ina clave para el desarrollo de tumores humanos. Dado que el motivo LxCxE se encuentra conservado en numerosas prote�inas virales y celulares que unen a Rb, los estudios presentados sientan las bases para el an�alisis de los mecanismos que permiten la discriminaci�on de diversas prote�inas que compitan por la uni�on al "surco LxCxE". The retinoblastoma tumor suppressor protein (Rb) is a hub protein wich plays a central role in cell cycle regulation in eukaryotic cells, and whose functional inactivation is associated with tumor progression in humans. In particular, the oncogenicity of high-risk human papillomavirus (HPV) depends critically on the interaction of one of its proteins, HPV-E7, with Rb. The delay in the understanding of structure-function relationships for Rb is due, to a large extent, to the difficulty in obtaining large quantities of pure protein which is amenable to biophysical analyses. In the present thesis, we studied the biophysical and interaction properties of the human RbAB domain, which mediates many of Rb's functions, amongst them the interaction with E7. We developed a protocol for its recombinant expression which allowed us to obtain up to 6 mg/liter of recombinant protein with ]95 por ciento purity. Biophysical studies showed that RbAB is a folded monomer at 20� C, but that it has marginal stability at the mammalian body temperature (37� C). Folding studies strongly suggest that the A and B domains have different thermodynamic stability. This work represents the first study of conformational properties of the RbAB domain in solution. In the second part of this thesis, we performed thermodynamic and kinetic analysis of the interaction between HPV-E7 and RbAB. These studies showed that 90 por ciento of the binding free energy is provided by the high affinity LxCxE linear motif, but that multiple regions in E7 additionally participate of the interaction, pointing to its modular nature. The intrinsically disordered nature of E7 modulates binding, and phosphorylation at a conserved CKII-PEST site potentiates binding affinity. Kinetic studies revealed that the LxCxE motif binds through a two-state route with a fast association, which is favoured by electrostatic interactions, and a complex lifetime of 20-200s. The electrostatic nature of the interaction may explain at least in part the binding specificity of different papillomavirus E7 proteins. The mechanistic study of protein-protein interactions is essential to the understanding of the complex cellular protein interaction networks, and the present thesis provides biophysical information on one of these interactions, using the E7-Rb interaction as a model system. Given that the LxCxE motif is conserved throughout viral and cellular Rb partners, the information provided by this work may set the grounds for analyzing the mechanisms of discrimination of multiple possible targets which bind the "LxCxE cleft".
Recurso electr�onico. Santa Fe, Arg.: e-libro, 2015. Disponible v�ia World Wide Web. El acceso puede estar limitado para las bibliotecas afiliadas a e-libro.
Prote�inas virales.
Viral proteins.
612.015756
577.112
La prote�ina supresora de tumores Retinoblastoma caracterizaci�on de su dominio AB y mecanismo de interacci�on con la oncoprote�ina E7 del papilomavirus humano = The Retinoblastoma tumor suppressor protein: caracterization of its AB domain and mechanism of interaction with the human papillomavirus E7 oncoprotein / Luc�ia Beatriz Chemes ; director: Gonzalo de Prat Gay. - Buenos Aires, Argentina : Universidad de Buenos Aires, 2010.
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
La prote�ina supresora de tumores retinoblastoma (Rb) es una prote�ina "hub" o central que juega un rol central en el control del ciclo celular en c�elulas eucariotas, y su inactivaci�on funcional se encuentra asociada a la progresi�on del c�ancer en humanos. En particular, la interacci�on de la prote�ina HPV-E7 con Rb se encuentra relacionada al poder oncog�enico del papilomavirus humano (HPV). El atraso en los estudios estructura-funci�on de Rb se debe en gran medida a la dificultad para la producci�on recombinante y el estudio en soluci�on de esta prote�ina o sus dominios. En la presente tesis, nos avocamos al estudio en soluci�on del dominio RbAB humano, que media una gran parte de las funciones de esta prote�ina incluyendo la interacci�on con HPV E7. Para ello, desarrollamos un protocolo para su expresi�on recombinante que permiti�o obtener rendimientos de 6 mg/litro con una pureza final mayor al 95 por ciento. Estudios biof�isicos revelaron que RbAB se encuentra en soluci�on como un mon�omero plegado a 20� C. RbAB es marginalmente estable a temperatura fisiol�ogica, y estudios de plegamiento sugieren que los sub-dominios RbA y RbB tienen diferente estabilidad en soluci�on. Estos estudios representan el primer an�alisis sobre las propiedades conformacionales en soluci�on de este dominio. En la segunda parte de la tesis realizamos un an�alisis termodin�amico y cin�etico de la interacci�on entre RbAB y HPV16-E7 en soluci�on. Estos estudios revelaron que el 90 por ciento de la energ�ia de interacci�on es aportado por el motivo lineal de alta afinidad LxCxE, pero que otros sitios secundarios en E7 participan de la interacci�on con el dominio RbAB, indicando que la misma es de car�acter modular. El caracter intr�insecamente desordenado de E7 modula la interacci�on, y la fosforilaci�on de la regi�on CKII-PEST potencia la afinidad del complejo. Estudios cin�eticos revelaron que la uni�on del motivo LxCxE a RbAB sigue un mecanismo de dos estados, con una asociaci�on r�apida y un tiempo de vida en el �orden de 20-200 seg. El complejo E7-RbAB se encuentra estabilizado por interacciones de tipo electrost�atico, que podr�ian determinar al menos en parte la especificidad de la interacci�on de las diferentes prote�inas E7 de papilomavirus. El estudio mecan�istico de las interacciones prote�ina-prote�ina es esencial para comprender el funcionamiento de las intrincadas redes de interacci�on presentes en las c�elulas, y la presente tesis aporta informaci�on sobre una de estas interacciones, tomando como prote�ina modelo a una prote�ina clave para el desarrollo de tumores humanos. Dado que el motivo LxCxE se encuentra conservado en numerosas prote�inas virales y celulares que unen a Rb, los estudios presentados sientan las bases para el an�alisis de los mecanismos que permiten la discriminaci�on de diversas prote�inas que compitan por la uni�on al "surco LxCxE". The retinoblastoma tumor suppressor protein (Rb) is a hub protein wich plays a central role in cell cycle regulation in eukaryotic cells, and whose functional inactivation is associated with tumor progression in humans. In particular, the oncogenicity of high-risk human papillomavirus (HPV) depends critically on the interaction of one of its proteins, HPV-E7, with Rb. The delay in the understanding of structure-function relationships for Rb is due, to a large extent, to the difficulty in obtaining large quantities of pure protein which is amenable to biophysical analyses. In the present thesis, we studied the biophysical and interaction properties of the human RbAB domain, which mediates many of Rb's functions, amongst them the interaction with E7. We developed a protocol for its recombinant expression which allowed us to obtain up to 6 mg/liter of recombinant protein with ]95 por ciento purity. Biophysical studies showed that RbAB is a folded monomer at 20� C, but that it has marginal stability at the mammalian body temperature (37� C). Folding studies strongly suggest that the A and B domains have different thermodynamic stability. This work represents the first study of conformational properties of the RbAB domain in solution. In the second part of this thesis, we performed thermodynamic and kinetic analysis of the interaction between HPV-E7 and RbAB. These studies showed that 90 por ciento of the binding free energy is provided by the high affinity LxCxE linear motif, but that multiple regions in E7 additionally participate of the interaction, pointing to its modular nature. The intrinsically disordered nature of E7 modulates binding, and phosphorylation at a conserved CKII-PEST site potentiates binding affinity. Kinetic studies revealed that the LxCxE motif binds through a two-state route with a fast association, which is favoured by electrostatic interactions, and a complex lifetime of 20-200s. The electrostatic nature of the interaction may explain at least in part the binding specificity of different papillomavirus E7 proteins. The mechanistic study of protein-protein interactions is essential to the understanding of the complex cellular protein interaction networks, and the present thesis provides biophysical information on one of these interactions, using the E7-Rb interaction as a model system. Given that the LxCxE motif is conserved throughout viral and cellular Rb partners, the information provided by this work may set the grounds for analyzing the mechanisms of discrimination of multiple possible targets which bind the "LxCxE cleft".
Recurso electr�onico. Santa Fe, Arg.: e-libro, 2015. Disponible v�ia World Wide Web. El acceso puede estar limitado para las bibliotecas afiliadas a e-libro.
Prote�inas virales.
Viral proteins.
612.015756
577.112