Nuevos enfoques en el diagn�ostico, prevenci�on y tratamiento de la mastitis bovina a trav�es del uso de mol�eculas con acci�on antimicrobiana New approaches in the diagnosis, prevention and treatment of bovine mastitis by using molecules with antimicrobial activity / Luciano Chaneton ; director: Leonardo E. Bussmann.

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.

El objetivo de esta tesis fue caracterizar el papel de lactoferrina (LF) y otros factores solubles end�ogenos, en la defensa de la gl�andula mamaria contra la infecci�on. Tambi�en, se busc�o analizar la potencial aplicaci�on de estos elementos para el diagn�ostico y la predicci�on de la mastitis bovina y para la generaci�on de ganado resistente a esta enfermedad. Para abordar estos objetivos se realizaron estudios bioqu�imicos, microbiol�ogicos y epidemiol�ogicos que se presentan en 4 apartados de resultados. En el primer apartado de resultados se propuso estudiar la relaci�on entre el incremento de los niveles de LF asociados a la infecci�on intramamaria y el agente causal involucrado. Los resultados obtenidos muestran que la concentraci�on de LF aumenta con la infecci�on cl�inica o subcl�inica y que la infecci�on con Streptococcus uberis est�a asociada a mayores niveles de LF en leche. Adem�as se demostr�o que Strep. uberis es capaz de inducir la s�intesis de LF in vitro y que este microorganismos es resistente a LF, lo que estar�ia indicando una asociaci�on entre la respuesta mediada por LF a la infecci�on y la sensibilidad a LF de los pat�ogenos. En el segundo apartado de resultados se profundizaron los hallazgos del primero realizando un estudio de cohorte de 80 vacas durante una lactancia completa. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la respuesta de LF es mayor en los primeros d�ias de lactancia; que los cuartos mamarios positivos para infecciones presentan tambi�en concentraciones de LF aumentadas antes y despu�es de la infecci�on y que cuartos con mayores concentraciones de LF durante el periparto presentan mayor riesgo de infectarse durante la lactancia. En el tercer apartado de resultados se analiz�o la actividad antimicrobiana de ?- lactoglobulina (?-LG) sobre bacterias causantes de mastitis. Se demostr�o que ?-LG inhibe el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y Strep. uberis pero no el de Escherichia coli en forma dosis dependiente. Este espectro de inhibici�on parece complementario al de LF. Adem�as, se hallaron diferencias de actividad espec�ifica entre dos variantes al�elicas de ?-LG: ?- LG A y ?-LG. Por �ultimo se demostr�o que LF y ?-LG pueden actuar en conjunto para inhibir el crecimiento de Strep. uberis y Staph. aureus. En el cuarto apartado de resultados se realizaron digestiones enzim�aticas de LF y los p�eptidos obtenidos fueron caracterizados bioqu�imica y microbiol�ogicamente. Uno de estos p�eptidos, identificado como la mol�ecula lactoferricina (LFcin), present�o mayor actividad antimicrobiana que LF y una cin�etica de inhibici�on diferente. El p�eptido LFcin fue expresado en forma recombinante como prote�ina de fusi�on con ?-LG en c�elulas CHO. Esta prote�ina quim�erica demostr�o alta actividad antimicrobiana contra Staph. aureus y Strep. uberis pero no contra E. coli. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de tesis aportan informaci�on relevante sobre el papel de LF y ?-LG en la infecci�on intramamaria y sobre la potencial aplicaci�on diagn�ostica y terap�eutica de estos elementos.

The aim of this thesis was to characterize the role of lactoferrin (LF) and other soluble factors in the defense of the mammary gland against infections. Additionally, we aimed to analyze the potential application of these elements in the diagnosis and prediction of bovine mastitis and in the generation of disease resistant cattle. To address these objectives we carried out biochemical, microbiological and epidemiological studies that are presented in 4 sections of results. In the first section we examined the relationship between the increase in LF levels associated with intramammary infection and the involved etiologic agent. Our results showed that the LF concentration increases upon clinical or subclinical infection and that infection with Streptococcus uberis is associated with the highest levels of LF in milk. We also showed that the challenge with Strep. uberis induced the synthesis of LF in vitro and that this microorganism is resistant to LF which suggests an association between infection response mediated by LF and pathogen susceptibility to this protein. In the second section, we extended the findings made in section 1. To do that, we carried out a longitudinal study over 80 cows during a complete lactation. The results indicated that: 1) LF response to infection is greater in the early days of lactation than in later stages. 2) infected quarters presented augmented levels of LF at sample times before and after the time of infection 3) quarters with higher concentrations of LF during peripartum presented increased risk of becoming infected afterwards. In the third section we analyzed the antimicrobial activity of ?-lactoglobulin (?-LG) towards mastitis-causing bacteria. We demonstrated that ?-LG inhibits the growth of Staphylococcus aureus and Strep. uberis but not Escherichia coli in a dose-dependent manner. This inhibition spectrum was complementary to the observed for LF. We also found differences in specific activity between two allelic variants of ?-LG: ?-LG A and ?-LG. Finally, we showed that LF and ?-LG can act together to inhibit the growth of Strep. uberis and Staph. aureus. In the fourth section, we performed enzymatic digestions of LF and the resulting peptides were characterized by means of biochemical and microbiological methods. One of the peptides obtained, identified as the molecule lactoferricin (LFcin), showed higher antimicrobial activity and different inhibition kinetics compared to LF. LFcin was expressed as a recombinant fusion protein with ?-LG. When expressed in CHO cells, this chimeric protein showed high antimicrobial activity against Staph. aureus and Strep. uberis but not against E. coli. Overall, the results presented in this thesis provide relevant information on the role of LF and ?-LG in intramammary infection and on the potential application of these molecules in the fight against bovine mastitis.

Recurso electr�onico. Santa Fe, Arg.: e-libro, 2015. Disponible v�ia World Wide Web. El acceso puede estar limitado para las bibliotecas afiliadas a e-libro.